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等溫滴定熱量儀ITC在生物分子
與納米顆粒相互作用研究中的應用
本文由馬爾文帕納科醫藥行業業務發展專家范洋晶供稿
2023
隨著納米技術的飛速發展，各種具有新穎功能的納米顆粒（Nanoparticles，NPs）已經在多個領域展現出廣泛的應用前景。納米顆粒與生物分子之間的相互作用是應用和了解其作用機制的基礎，特別是納米顆粒與蛋白質的相互作用是當前研究的重點，但是大多數分析方法都未能闡明其背后的形成機制。因此，洞悉納米顆粒與蛋白質的相互作用是一項具有挑戰性的任務。
等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）通過直接測量生物分子反應過程中吸收或放出的熱量，為研究各種各樣的生物分子相互作用提供了全面的信息。
MicroCal PEAQ-ITC 微量熱儀具有樣品量消耗少、靈敏度高、廣泛的親和力測量范圍和可選擇的高通量等優勢，通過一次實驗即可獲取結合相關的親和力 (KD)、化學結合計量比 (N)、焓變 (ΔH) 和熵變 (ΔS)等一整套熱力學信息。
ITC 不僅是藥物發現、蛋白質相互作用研究和調控的重要工具，也為深入了解蛋白質-納米顆粒相互作用的機制奠定基礎。
應 用 案 例
等溫滴定量熱法（ITC）
蛋白質可以吸附在大多數的納米顆粒上，這些相互作用大部分是放熱的，也有些是吸熱的。大多數蛋白質-納米顆粒相互作用的結果可以用 One set of sites 模型來擬合，各個蛋白位點和納米顆粒的結合具有相似的親和力。研究發現也存在適合 Two set of sites 模型的蛋白質-納米顆粒相互作用。圖1展示的細胞se素C 吸附在氨基酸包被的納米顆粒上發生了兩個結合事件，這可能是由于蛋白質構型的改變和由于更多蛋白質吸附到納米顆粒上導致的蛋白質間相互作用。
圖1：細胞se素C（CytC）吸附在氯基酸包被的納米顆粒(NPs)上的滴定曲線
有時也會出現傳統的單套或多套位點模型無法擬合的熱力學圖譜，圖2為 BSA 結合硫醇包被的金納米顆粒的滴定曲線。這種結合可能是由于納米顆粒和蛋白質的表面異質性造成的，因為一個納米顆?？梢蕴峁┎煌再|的位點供蛋白質結合，而一個蛋白質也可以使用不同的基團與納米顆粒表面結合。
圖2：BSA結合到硫醇包被的金納米顆粒（AuNPs）的滴定曲線
盡管蛋白質-納米顆粒存在不同的相互作用類型，但焓熵補償關系仍然成立。ΔH--TΔS線性圖的斜率和截距被認為是復合物形成時構象變化和去溶劑化的定量衡量。
圖3：NP-蛋白質相互作用研究中的 TΔS –ΔH線性圖，使用一系列大小、表面功能差異較大的NPs
ITC也可用于識別相互作用過程中可能的蛋白質聚集或變性。例如，BSA在帶正電荷的金納米顆粒上的吸附表現出兩個結合事件，第一步結合的TΔS為-200 kJ mol?1，而第二步結合的TΔS 為-1000 kJ mol?1，這種異常的大熵變被認為是由蛋白聚集所導致的。
圖4：BSA結合到帶正電荷的NP的滴定曲線
結論
Conclusion
生物分子-納米顆粒相互作用的熱力學研究是非常重要的，在很大程度上會影響后續的生物效應。例如，吸附蛋白的結合部分和結合強度可能決定其結構和功能的完整性。盡管許多分析技術可以用來描述蛋白質- 納米顆粒相互作用，但很少有技術能提供像 ITC 一樣多的定量信息。
等溫滴定量熱法是非標記和非破壞性的，通過提供一整套完整的熱力學信息研究蛋白質對納米材料的吸附，可作為一種補充技術幫助我們更好地理解蛋白質-納米顆粒的相互作用機制。
參考文獻
[1] Huang RX, Lau BLT. Biomolecule–nanoparticle interactions: Elucidation of the thermodynamics by isothermal titration calorimetry. Biochim Biophys Acta. 2016; 1860(5): 945-956.
[2] Prozeller D, Morsbach S, Landfester K. Isothermal titration calorimetry as a complementary method for investigating nanoparticle-protein interactions. Nanoscale. 2019; 11(41): 19265-19273.
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